图 2. TiN 生物芯片上微孔的 HRSEM

对于 PCR，它使用荧光染料作为光学传感器，染料分子从靶标受体结合的猝灭剂中释放出来以产生信号。 PCR 的优点是众所周知且具有经过验证的性能记录。 然而，PCR的局限性也很明显：

• 单次测量使用的染料数量相当有限。 随着染料数量的增加，颜色串扰也会增加，使得多重测量很难得出结论；
• PCR 需要聚合酶从正向和反向引物构建互补的 DNA/RNA 链。 然后，新构建的 DNA/RNA 螺旋会热变性以进一步复制。 不幸的是，构建-退化-复制过程并非没有错误；
• PCR 测试结果始终是定性的，因为它通过聚合酶和热循环测量 DNA/RNA 靶标的复制副本。 它不会告诉样本中最初存在的 DNA/RNA 目标的绝对拷贝数。

尽管现有的 SPR 系统不受 PCR 限制，但它们本身也存在问题。 其中一些问题非常重要，以至于阻碍了 SPR 成为体外诊断 (IVD) 的主要参与者：

• 金是商用 SPR 生物传感器的唯一材料。 它是非常昂贵的原材料，因为金价在十年内翻了一番；
• 需要新鲜制备的硫醇基化学品来激活金表面以实现生物传感。 这是关键的一步，硫醇分子不稳定，因此使操作方案变得复杂；
• 用于 SPR 生物传感的金膜沉积要求严格的厚度为 50 nm，精度为 1 nm。 金膜太厚或太薄都会降低SPR灵敏度。
• SPR 测量原理存在一个根本性的困境。 为了获得最佳灵敏度，需要通过光激发获得最佳共振。 然而，如果入射光完全转移到集体电子云振荡，则测量容易出现信噪比较差的情况。

为了解决这个问题，商业 SPR 系统测量偏离最佳共振的光强度以收集有意义的数据，但灵敏度会受到影响。

图 3. 我们的生物芯片的高倍率 HRSEM

为了解决现有 SPR 系统的局限性，我们发明了基于 TiN 纳米立方体的新一代激元生物传感芯片。 我们的生物芯片的高倍率 HRSEM 图像如图 3 所示。这款改变游戏规则的 TiN 激元生物传感芯片提供：

1. 在一次运行中对单个目标进行多达 144 个受体的大规模并行分析；
2. 用大小约45nm的合成氮化钛纳米立方体替代金薄膜，
   利用TiN材料的热等离子效应优势，使DNA/RNA 互补对直接杂交而进行检测；
3. 通过生物素化和化学吸附简化TiN表面功能化方案；
4. 测量等离子体增强弹性散射而不是衰减全内反射，从而获得更好的信噪比；
5. 通过 3D 打印实现灵活的制造。

图 4. 生物芯片表面元素Ti 和 N 的分布

凭借这些成果，我们的TiN技术已在中国和美国申请并获得了中国发明专利。 为了进一步说明TiN纳米立方体在生物芯片表面的分布，我们在最小尺度500纳米下进行了高分辨率扫描电子显微X射线能量色散分析（HRSEM-EDX）。 图4中的分布表明Ti和N以均匀分布存在。

为了研究 TiN 生物芯片功能化的表面化学，我们使用内部超级计算集群通过密度泛函理论 (DFT) [3] 和标准赝势库[4]计算 TiN(200) 表面上各种潜在候选分子的吸附能。 所有计算均使用开源 DFT 代码 Quantum-Espresso v6.7 [5]。 我们特别感兴趣的是寡核苷酸在 TiN 表面上的结合，即腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤 (G)、胞嘧啶 (C)、尿嘧啶 (U)。 模拟结果表明，这些核苷酸5'端的PO4官能团是TiN(200)上的首选锚定位置，具有最大的负吸附能。 而最不稳定的方向是通过位置 1' 处的基团。 吸附能差异非常明显，超过2电子伏特(eV)。 因此我们认为通过5'端PO4基团的吸附是共价吸附，而通过1'端碱基的吸附是范德华力。 这一发现实际上有利于在 TiN 表面锚定 DNA/RNA 序列并用于生物传感。 这是因为 DNA/RNA 的杂交总是通过 1' 碱基位置的氢键进行。 因此，通过 5' 位置锚定，它不会与互补碱基对的杂交竞争。 我们的 DFT 计算步骤的详细信息可以在模拟页面上找到。

凭借上述突破性发现，我们相信TiN生物传感器将为全球IVD市场带来一场免标签革命。

参考文献

[1] Surface Plasmon Resonance (SPR), https://en.wikipedia.org/wiki/Surface_plasmon_resonance

[2] Polymerase Chain Reaction (PCR), https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

[3] Density functional theory (DFT), https://en.wikipedia.org/wiki/Density_functional_theory

[4] Standard solid-state pseudopotentials, https://www.materialscloud.org/discover/sssp/table/efficiency

[5] Quantum ESPRESSO, https://www.quantum-espresso.org/

中国发明专利申请及授权：